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Jul 13, 2023

Winziger Diamantrotor könnte Proteinstudien verbessern

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Viele der biologischen Materialien, an deren Untersuchung Forscher am meisten interessiert sind, darunter auch solche, die mit schweren Krankheiten in Zusammenhang stehen, eignen sich nicht für die herkömmlichen Methoden, die Forscher normalerweise verwenden, um die Struktur und Chemie eines Materials zu untersuchen.

Eine Technik namens Magic-Angle-Spinning-Kernresonanz (MAS-NMR) hat sich als äußerst erfolgreiche Methode zur Bestimmung der Eigenschaften komplexer Moleküle wie einiger Proteine ​​erwiesen. Die mit solchen Systemen erreichbare Auflösung hängt jedoch von der Drehfrequenz winziger Rotoren ab, und diese Systeme stoßen an Grenzen, die durch die Rotormaterialien vorgegeben sind.

Die meisten dieser heute verwendeten Geräte basieren auf Rotoren aus Yttriumoxid-stabilisiertem Zirkonoxid, die so dünn wie ein Stift sind. Solche Rotoren zerfallen, wenn sie viel schneller als einige Millionen Umdrehungen pro Minute gedreht werden, was die Materialien, die mit solchen Systemen untersucht werden können, begrenzt. Doch jetzt haben Forscher am MIT eine Methode entwickelt, um diese winzigen, präzisen Rotoren aus reinem Diamantkristall herzustellen, dessen viel größere Festigkeit es ihm ermöglichen könnte, sich bei weitaus höheren Frequenzen zu drehen. Der Fortschritt öffnet die Tür zur Untersuchung einer Vielzahl wichtiger Moleküle, einschließlich derjenigen, die in den mit der Alzheimer-Krankheit verbundenen Amyloid-Plaques vorkommen.

Die neue Methode wird im Journal of Magnetic Resonance in einem Artikel der MIT-Absolventen Natalie Golota, Zachary Fredin, Daniel Banks und David Preiss beschrieben; die Professoren Robert Griffin, Neil Gershenfeld und Keith Nelson; und sieben weitere am MIT.

Die MAS-NMR-Technik, sagt Gershenfeld, „ist das Werkzeug der Wahl für die [Analyse] komplexer biologischer Proteine ​​in biologisch bedeutsamen Umgebungen.“ Beispielsweise könnte eine Probe in einer flüssigen Umgebung analysiert werden, anstatt sie zur Untersuchung auszutrocknen, zu kristallisieren oder zu beschichten. „Nur [Festkörper-]NMR funktioniert in der chemischen Umgebung“, sagt er.

Die grundlegende Methode gibt es schon seit Jahrzehnten, erklärt Griffin. Sie besteht darin, einen winzigen Zylinder, der mit dem zu untersuchenden Material gefüllt ist, in ein Magnetfeld zu bringen, wo er suspendiert und mithilfe von Gasstrahlen, normalerweise Stickstoff, auf hohe Frequenzen gedreht und dann gezapft wird mit Hochfrequenzimpulsen, um wichtige Eigenschaften des Materials zu bestimmen. Der Begriff „magischer Winkel“ bezieht sich auf die Tatsache, dass, wenn sich der Zylinder, der die Probe enthält, in einem genauen Winkel (54,74 Grad) relativ zum angelegten Magnetfeld dreht, verschiedene Quellen der Verbreiterung der Spektrallinien abgeschwächt werden und ein Spektrum mit viel höherer Auflösung entsteht ist möglich.

Die Auflösung dieser Spektren wird jedoch direkt dadurch begrenzt, wie schnell sich die winzigen Zylinder oder Rotoren drehen können, bevor sie zerbrechen. Im Laufe der Jahre wurden frühe Versionen aus verschiedenen Kunststoffen hergestellt, später wurden Keramikmaterialien und schließlich Zirkonium verwendet, „das ist das Material der Wahl, aus dem heutzutage die meisten Rotoren hergestellt werden“, sagt Griffin.

Solche MAS-NMR-Systeme werden in der biochemischen Forschung häufig als Werkzeug zur Untersuchung der molekularen Struktur von Materialien, einschließlich Proteinen, bis hin zur Ebene einzelner Atome eingesetzt, die mit anderen Standard-Labormethoden nur schwer oder gar nicht zu untersuchen sind. Dazu gehören nicht nur Amyloidfibrillen, sondern auch Membranproteine ​​und einige Virusaggregate. Doch einige der drängendsten Herausforderungen sowohl in der Biomedizin als auch in den Materialwissenschaften liegen gerade außerhalb der Reichweite der Auflösung heutiger MAS-NMR-Systeme.

„Als wir zu Rotationsfrequenzen über 100 Kilohertz gelangten, was 6 Millionen Umdrehungen pro Minute entspricht, sind diese Rotoren sehr problematisch geworden“, sagt Griffin. Sie versagen in etwa 50 Prozent der Fälle – und man verliert eine Probe und die NMR-Spule wird zerstört.“ Das Team beschloss, das damals von vielen für unmöglich gehaltene Problem in Angriff zu nehmen und die Rotoren aus einkristallinem Diamant herzustellen.

Sogar die Firma, die das von ihnen verwendete Lasersystem herstellte, glaubte, dass dies nicht möglich sei, und es bedurfte jahrelanger Arbeit eines interdisziplinären Teams, an dem Studenten und Forscher sowohl des Center for Bits and Atoms des MIT als auch der Fakultät für Chemie beteiligt waren, um diese Erfindung aufzuklären Problem. (Die Zusammenarbeit entstand aus der Mitarbeit von Griffin und Gershenfeld im Killian Award Committee des MIT). Sie entwickelten eine Art laserbasiertes Drehsystem, das ein Stück Diamant schnell dreht, während es mit dem Laser bearbeitet wird, wodurch im Wesentlichen seine äußeren Schichten verdampft werden, bis ein vollkommen glatter Zylinder mit einem Durchmesser von nur 0,7 Millimetern (etwa 1/36 Zoll) übrig bleibt. Anschließend wird mit demselben Laser ein perfekt zentriertes Loch durch die Mitte des Zylinders gebohrt, sodass eine Art Trinkhalmform entsteht.

„Es ist nicht offensichtlich, dass es funktionieren würde“, sagt Gershenfeld, „aber der Laser wandelt den Diamanten in Graphit um und treibt den Kohlenstoff aus, und das kann man schrittweise tun, um tief in den Diamanten zu bohren.“

Der Diamant entsteht aus dem Bearbeitungsprozess mit einer schwarzen Schicht aus reinem Graphit, aber die MIT-Forscher fanden heraus, dass diese durch Erhitzen des Rotors über Nacht auf etwa 600 Grad Celsius (etwa 1.100 Grad Fahrenheit) beseitigt werden könnte. Das Ergebnis ist ein Rotor, der dies bereits kann rotieren mit 6 Millionen Umdrehungen pro Minute, der Geschwindigkeit der besten Zirkonoxidrotoren, und weisen darüber hinaus weitere vorteilhafte Eigenschaften auf, darunter eine extrem hohe Wärmeleitfähigkeit und Hochfrequenztransparenz.

Fredin weist darauf hin, dass alle für die Herstellung dieses hochpräzisen Bearbeitungssystems erforderlichen Teile „alle genau hier entworfen und hergestellt“ wurden, in einem Kellerlabor im Center for Bits and Atoms. „Ein entscheidender Aspekt dieses Projekts war die Möglichkeit, alles physisch zu entwerfen, herzustellen und viele Male am Tag im eigenen Haus zu iterieren, anstatt Dinge an externe Maschinenwerkstätten schicken zu müssen.“

Mit diesen neuen Rotoren dürfte es nun möglich sein, deutlich höhere Rotationsfrequenzen zu erreichen, sagen die Forscher. Um die höheren Geschwindigkeiten und die damit verbundene Geschwindigkeit zu erreichen, müssten jedoch neue Lager und neue Systeme entwickelt werden, die auf Helium anstelle von Stickstoff basieren, um die Rotation anzutreiben Sprung in der Auflösung. „Es hat sich nie gelohnt, diese heliumkompatiblen Lager für diese kleinen Rotoren zu entwickeln, bis sich diese Technologie bewährt hat, als die bisher verwendeten Rotoren den Rotationsgeschwindigkeiten nicht standhalten konnten“, die am Ende bis zu 20 Millionen betragen könnten Umdrehungen pro Minute, sagt Golota.

Derart hohe Rotationsraten sind außerhalb des NMR-Bereichs nahezu unbekannt. Als Maschinenbauingenieur sagt Preiss: „Es kommt selten vor, dass sich etwas über Zehntausende Umdrehungen pro Minute dreht.“ Als er zum ersten Mal die Zahl von 6 Millionen U/min für diese Geräte hörte, sagte er: „Ich dachte irgendwie, das sei ein Witz.“

Aufgrund dieser hohen Geschwindigkeiten, sagt Gershenfeld, können aus jeder Unvollkommenheit leicht Instabilitäten entstehen: „Wenn es bei diesen Frequenzen auch nur eine leichte Asymmetrie in der Struktur gibt, ist man dem Untergang geweiht.“

Golota sagt, dass bei ihren Experimenten mit aktuellen Zirkonoxidrotoren „wenn die Rotoren ausfallen, sie explodieren und man im Wesentlichen nur Staub zurückgewinnt.“ Aber als die Diamantrotoren ausfielen, konnten wir sie unversehrt wiederherstellen. Sie speichern also auch die Probe, die für den Benutzer eine unschätzbare Ressource sein kann.“

Sie haben den neuen Diamantrotor bereits verwendet, um die Kohlenstoff-13- und Stickstoff-15-Spektren eines kleinen Peptids zu erzeugen, was die Leistungsfähigkeit des neuen Diamantrotormaterials deutlich demonstriert, das laut Griffin das erste neue Material für solche Rotoren ist, in dem entwickelt wurde die letzten drei Jahrzehnte. „Wir haben Spektren wie diese ausgiebig genutzt“, sagt er, „um die Struktur von Amyloid-Beta 1-42 zu bestimmen, einer toxischen Spezies bei der Alzheimer-Krankheit.“ Proben solchen Materials seien schwer zu bekommen und meist nur in winzigen Mengen erhältlich, sagt er. „Wir haben jetzt einen kleinen Rotor, der hoffentlich sehr zuverlässig sein wird, in den man zwei oder drei Milligramm Material einfüllen und Spektraldaten wie diese erhalten kann“, sagt er und zeigt auf die erhaltenen Probendaten. „Es ist wirklich spannend und wird viele neue Forschungsbereiche eröffnen.“

Diese Arbeit „ist wirklich bemerkenswert“, sagt David Doty, Präsident von Doty Scientific, einem Hersteller von NMR-Systemen, der an dieser Arbeit nicht beteiligt war. „Es wäre sehr schwer gewesen, jemanden außerhalb dieser Gruppe zu finden, der es für möglich gehalten hätte, Diamantrotoren mit einem Laser mit der für schnelles MAS erforderlichen Präzision zu bearbeiten, bevor er tatsächlich gesehen hätte, dass es funktioniert“, sagt er.

Doty fügt hinzu: „Was sie bisher gezeigt haben … ist geradezu erstaunlich.“ Wenn die erforderlichen zusätzlichen Fortschritte erzielt werden können, werden Hunderte von NMR-Forschern diese benötigen, um bessere Daten für die Projekte zu erhalten, an denen sie arbeiten, von der Verbesserung unseres Verständnisses einiger Krankheiten über die Entwicklung besserer Medikamente bis hin zur Entwicklung fortschrittlicher Batteriematerialien.“

„Diese neue Technologie hat das Potenzial, die Art und Weise, wie wir in Zukunft Festkörper-NMR-Experimente durchführen werden, grundlegend zu verändern und beispiellose experimentelle Möglichkeiten in Bezug auf Auflösung und Empfindlichkeit zu eröffnen“, sagt Anne Lesage, stellvertretende Direktorin des Instituts der Analytischen Wissenschaften an der Ecole Normale Supérieure in Lyon, Frankreich, der ebenfalls nicht mit dieser Arbeit verbunden war.

Zum Forschungsteam gehörten außerdem Salima Bahri, Daniel Banks, Prashant Patil, William Langford, Camron Blackburn, Erik Strand, Brian Michael und Blake Dastrup, alle vom MIT. Die Arbeit wurde von den US National Institutes of Health, dem CBA Consortia Fund, dem US Department of Energy und der US National Science Foundation unterstützt.

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